Calculadora de Tm de Oligonucleótidos
Calcule a temperatura de fusão de um oligonucleótido de ADN ou primer de PCR. O valor principal usa o método do vizinho mais próximo (SantaLucia 1998) com correção salina; a regra básica de Wallace e a estimativa por GC% são mostradas para comparação.
Introduza uma sequência de ADN (apenas A, C, G, T) para calcular a sua Tm.
Como funciona
A temperatura de fusão (Tm) é a temperatura à qual metade de um duplex de ADN se dissocia em cadeias simples. A estimativa mais precisa para oligonucleótidos usa a termodinâmica do vizinho mais próximo: cada par de bases adjacente contribui com uma entalpia (ΔH) e entropia (ΔS) conhecidas, e a Tm resulta de Tm = ΔH / (ΔS + R·ln(C_T/4)) com uma correção para a concentração salina. Esta calculadora usa os parâmetros unificados de SantaLucia 1998.
A concentração de catiões monovalentes (Na⁺) e a concentração da cadeia de oligo afetam ambas a Tm, pelo que deve introduzir os valores da sua reação. Para verificações rápidas, a regra de Wallace — 2 °C por A/T e 4 °C por G/C — funciona para oligonucleótidos curtos, e é mostrada uma fórmula baseada em GC% para sequências mais longas. A sequência deve conter apenas A, C, G e T (U é lido como T).
Exemplos
- GTAAAACGACGGCCAGT (primer direto M13) funde por volta dos 50 °C a 50 mM de Na⁺.
- Regra de Wallace: para um oligonucleótido de 17 bases com 8 A/T e 9 G/C, Tm = 2×8 + 4×9 = 52 °C.
- Aumentar a concentração salina ou a concentração de oligo aumenta a Tm.
Perguntas frequentes
- Qual é o método mais preciso?
- O método do vizinho mais próximo é o mais preciso para oligonucleótidos porque tem em conta a identidade das bases vizinhas, não apenas o conteúdo global de GC. É o valor principal apresentado aqui.
- Porque importam a concentração salina e de oligo?
- Os catiões estabilizam o duplex de ADN, aumentando a Tm, e uma concentração mais elevada da cadeia desloca o equilíbrio no sentido do duplex. Ambos aparecem na equação do vizinho mais próximo, pelo que introduzir os valores da sua reação dá uma Tm realista.
- Quando é que a regra de Wallace é suficiente?
- A regra de Wallace (2 °C por A/T, 4 °C por G/C) é uma estimativa rápida razoável para oligonucleótidos com menos de cerca de 14 bases, mas ignora o sal, a concentração e o contexto da sequência, pelo que se afasta em primers mais longos.
- Trata ARN ou bases ambíguas?
- O uracilo é lido como timina, mas os parâmetros do vizinho mais próximo são para ADN. Os códigos IUPAC ambíguos não são suportados — a sequência deve ser A, C, G e T (ou U).