Calcolatore di Tm per oligo
Calcola la temperatura di fusione di un oligo di DNA o di un primer per PCR. Il valore principale usa il metodo dei vicini più prossimi (SantaLucia 1998) con correzione salina; la regola di Wallace di base e la stima GC% sono mostrate per confronto.
Inserisci una sequenza di DNA (solo A, C, G, T) per calcolarne la Tm.
Come funziona
La temperatura di fusione (Tm) è la temperatura alla quale metà di un duplex di DNA è dissociato in filamenti singoli. La stima più accurata per gli oligo usa la termodinamica dei vicini più prossimi: ogni coppia di basi adiacenti contribuisce con un'entalpia (ΔH) e un'entropia (ΔS) note, e la Tm deriva da Tm = ΔH / (ΔS + R·ln(C_T/4)) con una correzione per la concentrazione salina. Questo calcolatore usa i parametri unificati di SantaLucia 1998.
La concentrazione di cationi monovalenti (Na⁺) e la concentrazione del filamento oligo influenzano entrambe la Tm, quindi inserisci i valori della tua reazione. Per controlli rapidi, la regola di Wallace — 2 °C per A/T e 4 °C per G/C — funziona per oligo corti, e una formula basata sul GC% è mostrata per sequenze più lunghe. La sequenza deve contenere solo A, C, G e T (U viene letta come T).
Esempi
- GTAAAACGACGGCCAGT (primer forward M13) fonde intorno a 50 °C a 50 mM Na⁺.
- Regola di Wallace: per un 17-mero con 8 A/T e 9 G/C, Tm = 2×8 + 4×9 = 52 °C.
- Aumentare la concentrazione salina o la concentrazione dell'oligo aumenta la Tm.
Domande frequenti
- Quale metodo è più accurato?
- Il metodo dei vicini più prossimi è il più accurato per gli oligonucleotidi perché tiene conto dell'identità delle basi vicine, non solo del contenuto GC complessivo. È il valore principale qui.
- Perché la concentrazione salina e dell'oligo sono importanti?
- I cationi stabilizzano il duplex di DNA, aumentando la Tm, e una concentrazione più alta del filamento sposta l'equilibrio verso il duplex. Entrambi compaiono nell'equazione dei vicini più prossimi, quindi inserire i valori della tua reazione dà una Tm realistica.
- Quando la regola di Wallace è sufficiente?
- La regola di Wallace (2 °C per A/T, 4 °C per G/C) è una stima rapida ragionevole per oligo più corti di circa 14 basi, ma ignora sale, concentrazione e contesto di sequenza, quindi si allontana dal valore reale per primer più lunghi.
- Gestisce l'RNA o basi ambigue?
- L'uracile viene letto come timina, ma i parametri dei vicini più prossimi sono per il DNA. I codici IUPAC ambigui non sono supportati — la sequenza deve essere A, C, G e T (o U).